在人體復(fù)雜的免疫防御網(wǎng)絡(luò)中，有一類細(xì)胞扮演著"哨兵"與"信使"的核心角色，它們就是樹突狀細(xì)胞。它們時(shí)刻監(jiān)視著機(jī)體的異常，一旦發(fā)現(xiàn)病原體或癌變細(xì)胞，便能迅速激活整個(gè)適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，發(fā)起精準(zhǔn)打擊。然而，直接從人體組織中獲取樹突狀細(xì)胞不僅困難，而且數(shù)量有限，極大地限制了科學(xué)研究。于是，科學(xué)家們找到了一把解開樹突狀細(xì)胞奧秘的金鑰匙------骨髓來源的樹突狀細(xì)胞。

一、 什么是BMDC？

骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，并非直接從生物體內(nèi)分離得到，而是在實(shí)驗(yàn)室里通過特定的細(xì)胞因子誘導(dǎo)小鼠骨髓前體細(xì)胞分化而成的一種細(xì)胞模型。

簡單來說，其制備過程如下：

1.獲取原料：從小鼠的股骨和脛骨中提取骨髓細(xì)胞。

2. 誘導(dǎo)分化：在培養(yǎng)皿中，將這些骨髓細(xì)胞與關(guān)鍵的細(xì)胞因子------粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子共同培養(yǎng)。

3. 發(fā)育成熟：經(jīng)過數(shù)天的培養(yǎng)，這些原本未定型的骨髓前體細(xì)胞，就會(huì)朝著樹突狀細(xì)胞的方向發(fā)育，形成具有典型樹突狀形態(tài)和功能的細(xì)胞群體。

雖然BMDC與體內(nèi)自然存在的樹突狀細(xì)胞在表型和功能上存在一些細(xì)微差異，但它們復(fù)刻了樹突狀細(xì)胞最核心的功能特征，使其成為免疫學(xué)研究中的工具。

二、小鼠BMDC誘導(dǎo)分化protocol

1.小鼠骨髓細(xì)胞獲取

1.1 將6-8周齡小鼠頸椎脫臼法處死，取股骨，去除骨周圍的肌肉組織。

1.2 用75%酒精浸泡消毒股骨2分鐘，PBS清洗2次。

1.3 用剪刀剪去股骨兩端，用注射器抽取PBS，針頭從骨兩端插入骨髓腔，反復(fù)沖洗直至骨變白。

1.4 收集骨髓懸液，用200目尼龍網(wǎng)過濾。

1.5 濾液1200rpm離心5分鐘，棄上清。

1.6 加入2ml 紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解3-5分鐘。

1.7 加入10ml PBS，1200rpm離心5分鐘。

1.8 棄上清，加入PBS清洗1次，用10%FBS的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

2. BMDC誘導(dǎo)

2.1 用培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1e6/mL，同時(shí)加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此為D0。

2.2 每2天進(jìn)行半換液，即取出半量培養(yǎng)基，離心收集懸浮細(xì)胞，用等體積的培養(yǎng)基重懸，并補(bǔ)充相應(yīng)濃度的細(xì)胞因子后加入皿中。

2.3 D6收集懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞，1200rpm離心5分鐘，棄上清將細(xì)胞密度調(diào)整為1e6/mL，同時(shí)加入GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，此為未成熟DC（immature DC）。

2.4 BMDC的成熟：在D8加入TNF-α (20ng/mL)，GM-CSF (20ng/mL)和IL-4 (20ng/mL)，D10收集懸浮細(xì)胞和貼壁生長的細(xì)胞。

3. 不成熟BMDC檢測

3.1 收集細(xì)胞：細(xì)胞因子干預(yù)后，棄培養(yǎng)基上清，用PBS清洗細(xì)胞1遍，棄上清，再將貼壁細(xì)胞用PBS輕輕吹打重懸。

3.2 計(jì)數(shù)：用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，并將按照1e7/mL重懸。

3.3 細(xì)胞封閉：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。

3.4 孵育抗體：各加入以下抗體，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。

組1：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD80 Antibody

組2：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD86 Antibody

3.5 洗滌細(xì)胞：用PBS洗滌細(xì)胞，去除殘留的抗體，并再次用PBS重懸。

3.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室溫避光孵育5min。

3.7 上機(jī)檢測。

4. 成熟BMDC（mature DC）檢測

4.1 收集細(xì)胞：細(xì)胞因子干預(yù)后，棄培養(yǎng)基上清，用PBS清洗細(xì)胞1遍，棄上清，再將貼壁細(xì)胞用PBS輕輕吹打重懸。

4.2 計(jì)數(shù)：用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，并將按照1e7/mL重懸。

4.3 細(xì)胞封閉：100μl/孔加至96孔板或流式管中，并加入Mouse IgG (Mouse FcR Blocking Reagent)，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。

4.4 孵育抗體：各加入以下抗體，4℃孵育30min，300Xg 離心5min，棄上清。

組1：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD80 Antibody

組2：PE anti-mouse CD11c Antibody

APC anti-mouse CD86 Antibody

4.5 洗滌細(xì)胞：用PBS洗滌細(xì)胞，去除殘留的抗體，并再次用PBS重懸。

4.6 死活染料染色：每孔加入7-AAD，室溫避光孵育5min。

4.7 上機(jī)檢測。

Loosely adherent BM derived cells were harvested and incubated with fluorescently labeled antibodies against various surface antigens.

About 65% cells are induced into DC by GM-CSF only group on Day 6, while ~78% by GM-CSF + IL-4 group. MHC-II+ DC cells is ~7% in GM-CSF group, while ~20% in GM-CSF + IL-4 group.

About 95% cells are induced into DC by GM-CSF only group on Day 10, while ~98% by GM-CSF + IL-4 group. MHC-II+ DC cells is ~14% in GM-CSF group, while ~40% in GM-CSF + IL-4+TNF-α group.

3. BMDC為何如此重要？

BMDC模型的建立，為免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、疫苗開發(fā)和藥物篩選等領(lǐng)域帶來了革命性的便利。

1.穩(wěn)定且充足的細(xì)胞來源

相比于從脾臟或淋巴結(jié)中費(fèi)力分離少量樹突狀細(xì)胞，BMDC技術(shù)可以在實(shí)驗(yàn)室中輕松獲得數(shù)以千萬計(jì)、性狀相對(duì)均一的細(xì)胞，為大規(guī)模實(shí)驗(yàn)提供了可能。

2. 研究免疫應(yīng)答的"理想窗口"

科學(xué)家可以利用BMDC來直觀地研究樹突狀細(xì)胞的"一生"：

抗原攝取：觀察BMDC如何吞噬、處理蛋白質(zhì)抗原或病原體。

成熟活化：研究在何種信號(hào)（如炎癥因子、病原相關(guān)分子模式）刺激下，BMDC會(huì)上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體、共刺激分子等，從而完成從"哨兵"到"信使"的轉(zhuǎn)變。

T細(xì)胞激活：在共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，直接觀察活化的BMDC如何有效地激活初始T細(xì)胞，引發(fā)特異性的免疫反應(yīng)。

3. 腫瘤免疫治療的研發(fā)平臺(tái)

在癌癥免疫治療領(lǐng)域，BMDC是制備樹突狀細(xì)胞疫苗的核心原料。研究人員可以先用腫瘤抗原在體外"訓(xùn)練"BMDC，再將這群"知情"的BMDC回輸?shù)襟w內(nèi)，去教育T細(xì)胞精準(zhǔn)識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。這種策略為個(gè)性化癌癥治療提供了廣闊前景。

4. 藥物與佐劑的安全性、有效性評(píng)估

新型疫苗佐劑或免疫調(diào)節(jié)藥物的效果如何？BMDC是一個(gè)的"試金石"。通過觀察藥物對(duì)BMDC成熟和功能的影響，可以快速預(yù)測其在體內(nèi)激活或抑制免疫反應(yīng)的能力，為后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供重要依據(jù)。

結(jié)語

骨髓來源的樹突狀細(xì)胞，這座連接基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用的橋梁，以其易得、穩(wěn)定和功能可靠的特點(diǎn)，極大地加速了我們對(duì)免疫系統(tǒng)的理解。從揭秘免疫激活的基本原理，到推動(dòng)創(chuàng)新療法走向臨床，BMDC作為免疫學(xué)家的得力助手，將繼續(xù)在人類對(duì)抗感染、癌癥和自身免疫疾病的征程中，扮演著不可或替代的關(guān)鍵角色。