在生命科學(xué)的宏偉圖景中，蛋白質(zhì)就如同這臺機器的精密部件，它們執(zhí)行著細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的生命活動，從信號傳遞、物質(zhì)運輸?shù)侥芰慨a(chǎn)生，無一不包。而蛋白質(zhì)磷酸化一種蛋白翻譯后修飾（PTM），指在蛋白質(zhì)激酶的催化下，將三磷酸腺苷（ATP）γ位的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移至蛋白質(zhì)的特定氨基酸殘基（主要為絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸）的過程。這一過程可逆，由磷酸酶催化去磷酸化。蛋白磷酸化則是蛋白質(zhì)功能調(diào)控中最常見、最關(guān)鍵的機制之一，堪稱生命活動的“開關(guān)“。 WB實驗是最常見的蛋白質(zhì)磷酸化檢測方式，那在具體研究中我們該如何把控總蛋白和磷酸化蛋白的檢測呢？

圖 1 蛋白磷酸化機制

一、為什么檢測總蛋白？

1. 量化蛋白質(zhì)表達(dá)水平：

①整體豐度評估：總蛋白檢測可以告訴你某個特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞、組織或生物樣品中的整體數(shù)量。這對于了解基因表達(dá)的產(chǎn)物水平非常重要

②作為對照：當(dāng)檢測磷酸化蛋白時，總蛋白水平的穩(wěn)定或變化可以幫助你判斷觀察到的磷酸化變化是由于蛋白質(zhì)數(shù)量的改變還是磷酸化狀態(tài)的改變

③樣品加載量標(biāo)準(zhǔn)化：在進(jìn)行Western Blotting等技術(shù)時，通常會使用總蛋白含量作為標(biāo)準(zhǔn)，以確保不同樣品之間的蛋白質(zhì)上樣量一致，從而使得蛋白豐度的比較更加準(zhǔn)確。

④初步篩查：在探索性研究中，檢測總蛋白可以快速了解一組基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步深入研究提供方向

2.確認(rèn)特定蛋白質(zhì)的存在：

驗證表達(dá)：使用針對特定蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行WB 實驗，可以確認(rèn)該蛋白質(zhì)在樣品中是否存在。確定蛋白存在之后，才能進(jìn)行下游的實驗

3.作為其他分析的基線：

①蛋白質(zhì)組學(xué)研究：在復(fù)雜的蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，了解總蛋白組成有助于理解樣品的全貌。

②功能研究：蛋白質(zhì)的豐度是其發(fā)揮功能的基礎(chǔ)。如果某個蛋白質(zhì)的總量顯著下降，即使其磷酸化水平不變，其功能也可能受到影響。

二、為什么要檢測磷酸化蛋白？

1.揭示信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：

①激活/失活狀態(tài)：磷酸化通常是激活或失活蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵步驟。檢測特定位點的磷酸化水平，可以判斷下游信號是否被激活

②信號級聯(lián)：許多信號通路是通過一系列蛋白質(zhì)的順序磷酸化來傳遞信息的。檢測通路中關(guān)鍵激酶及其底物的磷酸化狀態(tài)，可以追蹤信號的傳遞過程

③動態(tài)調(diào)控：磷酸化是一種高度動態(tài)的修飾，可以快速響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的變化。檢測磷酸化蛋白能夠捕捉這種瞬時的信號變化

2.理解蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)：

①改變活性：磷酸化可以改變蛋白質(zhì)的酶活性、與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合能力、亞細(xì)胞定位等

②參與細(xì)胞過程：細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞生長、凋亡、免疫應(yīng)答、代謝等幾乎所有重要的細(xì)胞過程都受到磷酸化蛋白的調(diào)控

3.識別疾病生物標(biāo)志物：

①異常磷酸化：許多疾病，尤其是癌癥，與異常的蛋白磷酸化模式有關(guān)。異常磷酸化可能導(dǎo)致細(xì)胞生長失控、信號傳導(dǎo)異常。

②藥物靶點：許多藥物（如激酶抑制劑）就是針對異常磷酸化過程中的關(guān)鍵激酶或磷酸化蛋白設(shè)計的。檢測這些蛋白的磷酸化狀態(tài)可以評估藥物的療效或監(jiān)測耐藥性。

三、總蛋白與磷酸化蛋白：為何必須“并駕齊驅(qū)"？

既然磷酸化如此重要，為什么我們不能只檢測磷酸化蛋白，而要同時檢測總蛋白呢？這里面大有學(xué)問，并且具有不可替代的重要性：

1.確立“基線"：總蛋白是參照系，沒有它，磷酸化就沒有意義

磷酸化水平是相對于總蛋白水平而言?？偟鞍妆茸饕惠v汽車的總零件數(shù)量，而磷酸化蛋白則像是那些被“激活"了某個功能（例如，引擎啟動，剎車系統(tǒng)就緒）的零件。

①判斷相對變化：如果我們只看到磷酸化蛋白的數(shù)量增加了，但不知道總蛋白的數(shù)量是保持不變、增加還是減少，我們就無法準(zhǔn)確判斷磷酸化蛋白的“相對豐度"。例如，如果總蛋白數(shù)量翻倍，而磷酸化蛋白數(shù)量也翻倍，那么磷酸化水平可能并沒有實質(zhì)性改變；但如果總蛋白數(shù)量不變，磷酸化蛋白數(shù)量翻倍，則說明磷酸化水平顯著提高。總蛋白提供了一個必要的參照系，讓我們能夠準(zhǔn)確地量化磷酸化蛋白的相對豐度，從而判斷磷酸化事件的強度。

②排除假陽性/假陰性：有時，蛋白質(zhì)的總表達(dá)水平本身就會發(fā)生變化。如果僅僅看到磷酸化蛋白水平的變化，而忽略了總蛋白的變化，我們可能會誤判。例如，如果某種致病因素導(dǎo)致了某個靶蛋白的表達(dá)大幅增加，同時又導(dǎo)致其磷酸化水平升高，那么僅僅看到磷酸化蛋白的升高，可能只是反映了總蛋白表達(dá)的增加，而非磷酸化本身的異常激活。

2.探究表達(dá)調(diào)控與磷酸化調(diào)控的協(xié)同作用：生命調(diào)控的“雙重奏"

總蛋白的表達(dá)水平本身就是一種重要的調(diào)控機制。細(xì)胞可以控制一個蛋白的產(chǎn)生量，也可以控制它的磷酸化狀態(tài)，這兩種調(diào)控往往是協(xié)同作用的。

①理解通路激活機制： 某些信號通路在激活時，會同時上調(diào)靶蛋白的表達(dá)和磷酸化。例如，在某些生長因子刺激下，細(xì)胞可能不僅會增加特定信號蛋白的產(chǎn)生，還會對其進(jìn)行磷酸化激活。同時檢測總蛋白和磷酸化蛋白，有助于我們理解這種“量"與“活"的協(xié)同調(diào)控機制，從而更全面地解析信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

②區(qū)分不同層面的調(diào)控： 有時，一個疾病或生理過程的發(fā)生，可能源于蛋白質(zhì)表達(dá)的異常，也可能源于磷酸化狀態(tài)的異常，甚至兩者兼有。通過同時檢測，我們可以區(qū)分是蛋白“數(shù)量"不足/過剩導(dǎo)致了問題，還是蛋白“狀態(tài)"不對（即磷酸化異常）導(dǎo)致了問題，從而更精確地定位病因和設(shè)計治療策略。

3.評估磷酸化效率：理解“開關(guān)"的靈敏度

磷酸化反應(yīng)的效率，即有多少總蛋白被磷酸化了，也是一個重要的生物學(xué)信息。

①評估激酶活性：磷酸化反應(yīng)是由激酶催化的。通過比較磷酸化蛋白和總蛋白的水平，我們可以間接評估特定激酶的活性。如果總蛋白水平穩(wěn)定，而磷酸化蛋白水平隨時間推移而顯著增加，則表明激酶活性很高。

②理解反饋機制：細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的反饋調(diào)控機制。磷酸化狀態(tài)的變化可能會影響蛋白的穩(wěn)定性或其與其他蛋白的相互作用，進(jìn)而影響其表達(dá)水平。同時檢測兩者，有助于揭示這些復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

總結(jié)來說，檢測總蛋白是為了了解蛋白質(zhì)的“基礎(chǔ)含量"，而檢測磷酸化蛋白是為了了解蛋白質(zhì)的“激活狀態(tài)"和“功能調(diào)控"。這兩種檢測是相互依賴、互為補充的，是深入理解生命活動和疾病發(fā)生機制的手段。結(jié)合總蛋白和磷酸化蛋白的檢測結(jié)果，才能更全面地理解蛋白質(zhì)的表達(dá)、狀態(tài)和功能。

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蛋白磷酸化檢測：為何要同時“看"見總蛋白與磷酸化蛋白？