單克隆抗體由單一 B 淋巴細(xì)胞克隆產(chǎn)生的、氨基酸序列與空間構(gòu)象均一的免疫球蛋白。其核心特征是能專一識(shí)別并結(jié)合抗原分子上的單一抗原決定簇，具有特異性強(qiáng)、批次間差異小、可規(guī)?；a(chǎn)的特點(diǎn)，是生物制藥、精準(zhǔn)診斷及生命科學(xué)研究的核心工具。

一、單克隆抗體制備方法

目前對(duì)于單克隆抗體的開(kāi)發(fā)一共有3大技術(shù)路線，一是傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)平臺(tái)，該技術(shù)篩選的是抗體分泌型漿B細(xì)胞（Plasma B cells）；二是噬菌體展示技術(shù)，該技術(shù)直接對(duì)B細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序和建庫(kù)，抗體序列來(lái)源可以是漿細(xì)胞也可以是記憶細(xì)胞（Memory B cells）；三是基于單B細(xì)胞直接測(cè)序或者基于B細(xì)胞體外培養(yǎng)篩選后測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)抗體序列來(lái)源可以是漿細(xì)胞也可以是記憶細(xì)胞。每種方法都具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用，本期重點(diǎn)講解單B細(xì)胞抗體篩選技術(shù)。

二、單B細(xì)胞制備抗體流程

圖一：詳細(xì)實(shí)驗(yàn)流程

(I) B細(xì)胞分離
第一階段旨在分離專門針對(duì)所選抗原的單個(gè)B細(xì)胞。為此，單個(gè)B細(xì)胞被熒光標(biāo)記的抗原(蛋白質(zhì)、病毒粒子或表達(dá)抗原的細(xì)胞)染色并分類到多孔板中。圖一中，通過(guò)密度離心法從外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），然后用磁珠富集B細(xì)胞，并用熒光標(biāo)記的誘餌蛋白進(jìn)行單細(xì)胞分選，分選至 96 孔板中。

(II) PCR擴(kuò)增
第二階段進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后在嵌套或半套式多引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中擴(kuò)增自然配對(duì)的重鏈和輕鏈，可以通過(guò)測(cè)序分析擴(kuò)增的重鏈和輕鏈，以鑒定克隆關(guān)系并從分離的B細(xì)胞中推斷出譜系特征。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物的選擇至關(guān)重要，因?yàn)樗鼈冃枰采w所有不同的V基因片段，不能在編碼V區(qū)引起突變，并且需要兼容以進(jìn)行多路復(fù)用。

(III) 克隆
第三階段在克隆階段，第一階段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物在克隆聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(第三階段)中用計(jì)算優(yōu)化的引物混合物進(jìn)行擴(kuò)增，以將懸垂部分添加到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，對(duì)于每條鏈，挑選單個(gè)克隆并用于接種96孔板液體培養(yǎng)和菌落PCR反應(yīng)混合物，對(duì)菌落PCR進(jìn)行測(cè)序分析，確定正確插入的可變區(qū)，并在液體培養(yǎng)中添加甘油進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

(IV) 抗體生產(chǎn)
對(duì)于高通量或大規(guī)?？贵w生產(chǎn)，正確克隆的液體培養(yǎng)物或甘油庫(kù)存用于接種96孔小型(高通量)或搖瓶中尺度(大規(guī)模，低通量)細(xì)菌培養(yǎng)物，在高通量方案中，用96孔格式的質(zhì)粒-DNA隔離柱制備DNA，并以48孔或96孔格式轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，上清液可直接用于下游分析，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或微量中和分析，無(wú)需進(jìn)一步純化。為了規(guī)模化生產(chǎn)，將重鏈和輕鏈的中型DNA導(dǎo)入HEK293-6E細(xì)胞，通過(guò)蛋白G親和純化純化單抗，用于下游檢測(cè)。

三、B細(xì)胞"技術(shù)"強(qiáng)勢(shì)賦能：抗體開(kāi)發(fā)一步到位！

為縮短客戶的抗體開(kāi)發(fā)周期、減輕研發(fā)負(fù)擔(dān)，斯達(dá)特推出了全新抗體開(kāi)發(fā)平臺(tái)——兔單B細(xì)胞抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)平臺(tái)。與傳統(tǒng)抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)相比，我們的兔單B細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)特定B細(xì)胞的高特異性篩選，還能夠保留抗體重鏈和輕鏈的天然配對(duì)以提高抗體的親和力和功能性。

重組兔單B細(xì)胞抗體服務(wù)流程

重組兔單B細(xì)胞抗體服務(wù)詳情

抗體篩選效率低？單B細(xì)胞抗體制備技術(shù)詳解來(lái)了